Animales transgénicos basados en cromosomas artificiales

La tecnología actual para transferir genes a través de la línea germinal de mamíferos requiere la integración de ADN exógeno desnudo en un sitio aleatorio dentro del genoma del hospedador. Sin embargo, este proceso puede generar efectos de posición indeseables así como mutaciones perjudiciales. Los cromosomas artificiales de mamíferos son buenos vectores para la producción de transgénesis, así como para la producción de proteínas celulares y aplicaciones en la terapia génica. Esto es así porque tienen la ventaja de:
Transportar grandes moléculas de ADN
La posibilidad de replicarse paralelamente al genoma del hospedador, pero sin integrarse en él.
Se transmiten a través de la línea germinal.

Los cromosomas artificiales basados en ADN satélite (SATAC) contienen:
Orígenes de replicación no virales
Telómeros
Centrómero

Todo ello para permanecer estables en el cromosoma de la célula huésped. 60 Mb son el prototipo de un SATAC e incluyen secuencias de heterocromatina no codificante entremezcladas con genes marcadores como lac Z (β- galactosidasa) y hph (higromicina fosfotransferasa).

El procediento para la transgénesis y el posterior seguimiento de la presencia del cromosoma artificial sería enesencia como sigue:
Aislamiento de SATACs y concentración, mediante citometría de flujo, y posteriormente se recogen por centrifugación.
Se cultivan los embriones receptores, por ejemplo de ratón
Se realiza una microinyección de los SATACs en los pronúcleos de raton, utilizando micropipetas de vidrio borosilicadas.
Se extrae el ADN genómico total y se amplifica por PCR para probar la presencia de higromicina. Luego se realiza una tinción de B-galactosidasa para probar la actividad del gen lac Z (ambos genes están presentes en el SATAC).
Por último se realiza una hibridación in situ fluorescente (FISH) de los embriones cultivados con un medio en colcemida (detiene las células en fase M), con sondas de ADN satélite, lac Z y hph.

Se ha observado que los cromosomas artificiales se pueden transmitir correctamente durante las mitosis y a la descendencia del individuo transgénico, permitiendo la supervivencia de un porcentaje acepatable de individuos. La creación de ratones transgénicos con SATAC también abre amplias aplicaciones en áreas como la genómica funcional y la creación de animales modelo para enfermedades humanas.


por: Catalina Florez